分光光度法 50 管/48 樣

注意：正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

GSH-Px 是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)中催化還原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px

不僅能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與 ROS 反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽 GSSG，從而保護(hù)

生物膜免受 ROS 的損害，維持細(xì)胞的正常功能；而且具有保護(hù)肝臟、提高機(jī)體免疫力、拮

抗有害金屬離子對機(jī)體的傷害和增加機(jī)體抗輻射等能力。

測定原理：

GSH-Px 催化 H₂O₂ 氧化 GSH，產(chǎn)生 GSSG；谷胱甘肽還原酶（GR）催化 NADPH 還原 GSSG，

再生 GSH，同時(shí) NADPH 氧化生成 NADP⁺；NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，而 NADP⁺

沒有；通過測定 340 nm 光吸收減少速率來計(jì)算 GSH-Px 活性。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL 石英比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體 100mL×1 瓶，室溫保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 20μL×1 支，-20℃保存。

混合試劑配制：臨用前，在試劑二中加入試劑一 40 mL，充分震蕩溶解后加入全部試劑三，

混勻。（注意：必須現(xiàn)配現(xiàn)用，當(dāng)天使用完）

試劑四：液體 5.1mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提�。�

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，

加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建

議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7

秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

測定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 混合試劑在 25℃或者 37℃（哺乳動物）水浴中預(yù)熱 30min。

3. 測定管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 試劑四、800μL 預(yù)熱的混合試劑、100μL

上清液， 迅速混勻后于 340nm 處測定第 10 s 和第 190s 的吸光值，分別記為 A 測 1 和 A 測

2，△A 測定管= A 測 1﹣A 測 2。

計(jì)算公式：

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

GSH-Px 活力單位定義：一定溫度中，每 mg 蛋白每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶

活單位。

GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[△A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（Cpr×V 樣）÷T

=536×△A 測定管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

GSH-Px 活力單位定義：一定溫度中，每 g 樣本每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶活

單位。

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