蛋白質(zhì)含量的測(cè)定——紫外（uv）吸收測(cè)定法
目的要求
1、了解紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。
2、掌握紫外分光光度計(jì)的使用方法。
實(shí)驗(yàn)原理
蛋白質(zhì)分子中所含酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)處有最大吸收值。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值（A280）與其含量成正比關(guān)系，可用作定量測(cè)定。
紫外線吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速，簡(jiǎn)便，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。因此，廣泛應(yīng)用在柱層析分離中蛋白質(zhì)洗脫情況的檢測(cè)。此法的缺點(diǎn)是：1、對(duì)于測(cè)定的那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差；2、若樣品中核酸等吸收紫外線的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。
不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外線吸收是不同的，即使經(jīng)過校正，測(cè)定結(jié)果也還存在一定的誤差。但是可作為初步定量的依據(jù)。該法可測(cè)定蛋白范圍應(yīng)在0.1～1.0mg/mL。
試劑和器材
1、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液
（1）、標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度配制成1mg/ml蛋白溶液。
（2）、待測(cè)蛋白質(zhì)溶液。人血清，使用前稀釋100倍。
2、器材
試管1.5cm×15cm（×9），試管架，移液管1mL（×3）；2mL（×2）；5mL（×2）；分光光度計(jì)。
操作方法
1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
取8支試管編號(hào)，分別向每支試管加入各種試劑，搖勻。選用光程為1cm的石英比色杯，在280nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定各管溶液的A280值。以A280值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、樣品測(cè)定
取待測(cè)蛋白質(zhì)溶液1mL，加入蒸餾水3mL搖勻，按上述方法在280nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。
注意事項(xiàng)
由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。此外，蛋白溶液中存在核酸或核苷酸時(shí)也會(huì)影響紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確性。
原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司
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