ELISA試劑盒使用中酶結(jié)合過(guò)程
酶結(jié)合物即酶標(biāo)記物（或抗原）,是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的酶結(jié)合物應(yīng)該是既有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤�，在結(jié)合試劑中應(yīng)精良不含有貨不含有游離的（未結(jié)合的）酶活游離的抗體（或抗原）.此外，酶結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。
酶
用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留他的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本易于測(cè)定等。在ELISA中，常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶 和踐行磷酸酶 在少數(shù)商品ELISA中應(yīng)用酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等、
國(guó)產(chǎn)ELISA試劑盒中一般采用HRP制備結(jié)合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%分子量為44000KD，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵紅蛋白素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)，主酶無(wú)色糖蛋白在275nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰。HRP的純度用RZ標(biāo)示，是403nm的吸收度與280nm吸光度之比。高純度的HRP的RZ大于等于3.0
HRP除符合上述的ELISA中標(biāo)記酶的要求外，更有價(jià)格低廉和性質(zhì)較為穩(wěn)定的等特定，值得注意的是，在選用酶制劑時(shí)，處其純度外，跟應(yīng)該注意沒(méi)的活力。高純度的酶如果保存不當(dāng)，活力也會(huì)降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位標(biāo)示，可用對(duì)底物作用后生成產(chǎn)物量的測(cè)定進(jìn)行試驗(yàn)。
抗原和抗體
制備結(jié)合物時(shí)采用抗體一般為純度較高的IgG，以免在酶聯(lián)結(jié)室其他雜蛋白干擾。最好用親和層析純的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特意的免疫活性，可以再高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底干凈。如果F（ab)2進(jìn)行標(biāo)記，則更可避免標(biāo)本中RF的干擾。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的
ELISA-酶結(jié)合物的制備
酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種：戊二醛交聯(lián)法和國(guó)電酸鹽氧化法。
戊二醛交聯(lián)法
戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，他可以使酶與蛋白質(zhì)氨基酸通過(guò)它二鏈接。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法分一步走兩步走兩種。在一部法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后記得酶標(biāo)記抗體。
ELISA中常用的酶一般用此法交聯(lián)。它具有操作簡(jiǎn)便，有效和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)時(shí)隨機(jī)的。酶與抗體交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格，結(jié)合物的大小不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有坑內(nèi)交聯(lián)，影響效果，在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，在于酶酶結(jié)合。兩步法的產(chǎn)額不中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是1:1的比例結(jié)合。較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高靈敏度但其偶聯(lián)的有效率較一步法差。
ELISA-酶結(jié)合物的保存
沒(méi)變抗體中酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當(dāng)，極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存1年左右，但凍干過(guò)程中引起活力的減低，而且使用時(shí)需經(jīng)復(fù)溶，頗為不變。結(jié)合物溶液中加入燈體的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱中較長(zhǎng)時(shí)間保存。早期的ELISA試劑盒中的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應(yīng)，配制稀釋液，臨用時(shí)按表明的稀釋度稀釋成工作液�，F(xiàn)在先進(jìn)的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作也，使用時(shí)不需再行稀釋，在4-8攝氏度保存期長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月。由于蛋白質(zhì)濃度較低，結(jié)合物易失活。需要加入蛋白保護(hù)劑，聯(lián)外加入抗生素和防腐劑以防止細(xì)菌聲場(chǎng)。
ELISA-酶結(jié)合物的稀釋液
用于稀釋高濃度的結(jié)合物一賠成工作也。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)，通常競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)合物的吸附，一般還加入具有抑制蛋白吸附于塑料表面的非離子型活性劑。如圖為-20 ，0.5%的濃度較為適宜。在間接測(cè)定抗體時(shí)，血清標(biāo)本須稀釋后驚醒測(cè)定，也可應(yīng)用這種稀釋液
ELISA-酶的底物
HRP的底物
HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng)，應(yīng)最具代表性的過(guò)氧化物為H2O2其反應(yīng)式如下
DH2+H2O2→D+2H2O
上式中，DH2wei 供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后生成有色的產(chǎn)物，以便作比色測(cè)定。常用的供氫體為鄰苯二胺、四甲基聯(lián)苯胺、ABTS。OPD本身難溶于水，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式。片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過(guò)啊氧化氫則胚乳底物緩沖液中，有支撐一曹村的濃縮液，使用時(shí)用蒸餾水稀釋。陷阱的萬(wàn)里沙試劑盒中則直接配成含寶貝虎劑的工作濃度為0.02%H2O2的應(yīng)用液，只需加入OPD即可作為底物應(yīng)用液。TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，木事對(duì)比鮮明。TMB性質(zhì)穩(wěn)定可配成溶液試劑。只需與H2O2溶液混合既成應(yīng)用液，可直接做底物使用。另外,TMB無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL和H2SO4終止后，TMBA產(chǎn)物有藍(lán)色呈黃色，可在比色中定量，最適吸收波長(zhǎng)為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些實(shí)際和所采用。
另一種HRP的底物為3-（4-羥基）苯丙酸經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計(jì)測(cè)量。用于ELISA有點(diǎn)味可加寬定量測(cè)定的線性范圍
HRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分子醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物。H2O2應(yīng)用最多，但尿素過(guò)氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便，穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過(guò)氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉，低溫（2--8℃）可穩(wěn)定1年。
AP的底物
AP為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基苯分，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮）,可用于ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于顯色底物的比色法。
ELISA洗滌液
在板式ELISA中，常用的稀釋液為磷酸緩沖液或Tris-HCL緩沖液，加入0.05%Tween-20可加強(qiáng)去除非特異性反應(yīng)的作用。一些洗滌儀器設(shè)計(jì)有特殊的沖洗裝置，用蒸餾水做洗滌液，同樣有徹底洗滌的效果。
ELISA終止液
常用HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在辦事ELISA中一般采用2mol/L
陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品
陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也做為判斷結(jié)果的對(duì)照，因此對(duì)照品，特備是陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測(cè)定，對(duì)照品最好也為人血清因?yàn)檎Ｈ嗽S晴在跟中ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血清較難得到，國(guó)外試劑盒中的對(duì)照品多以復(fù)鈣人血漿為原料，記載血漿中加入鈣離子，十七中的纖維蛋白質(zhì)凝固，出去凝塊后所得的液體，其組成與血清相同
陰性對(duì)照品現(xiàn)行檢測(cè)，去頂其中不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg,UI好抗HBs也是陰性。陽(yáng)性對(duì)照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基礎(chǔ)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)。加入的量英語(yǔ)試劑敏感度相稱，在代測(cè)中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可對(duì)標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有個(gè)粗略的估計(jì)。
代測(cè)樣品：
可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛，血清、血漿或其他體液均可作為酶免疫測(cè)定法中使用的大側(cè)標(biāo)本，代測(cè)標(biāo)本的質(zhì)量液影響最后的測(cè)定結(jié)果。標(biāo)本中蛋白質(zhì)濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生非特異性吸附干擾固相包被，而過(guò)分稀釋的血清或血漿會(huì)影響抗原-抗體之間的免疫學(xué)反應(yīng)，標(biāo)本中可能存在的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶會(huì)干擾顯色反應(yīng)等，客服或減少這些問(wèn)題的最簡(jiǎn)單拌飯Shiite采用適當(dāng)?shù)南♂屴k法，再去定包被液濃度、酶結(jié)合物濃度及孵育時(shí)間后，將達(dá)側(cè)血清標(biāo)本不同程度的稀釋后按elisa生產(chǎn)工藝操作，比較血清各稀釋度反應(yīng)后測(cè)得吸光度值，一般去值為1.0時(shí)稀釋度為宜。然而稀釋法雖然可減少樣品中的蛋白質(zhì)或其他成分火谷鄉(xiāng)菲特西行結(jié)合及降低底物反應(yīng)式的非特異性顯示程度，但也可能降低酶免疫法的檢測(cè)的敏感性。
人血清中的自身抗體成分，特別是類風(fēng)濕因子對(duì)雙抗體夾心法次頂有一定影響。是造成假陽(yáng)性反應(yīng)的原因之一，測(cè)定HBsAg或甲胎蛋白時(shí)常出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。因此HBsAg篩選實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性者還要用抗-HBs中和后做確診實(shí)驗(yàn)，測(cè)AFP時(shí)則在標(biāo)本中先用已加熱聚合的人IgG與可能存在的類風(fēng)濕因子反應(yīng)，已消除類風(fēng)濕因子的干擾作用。保存的血清標(biāo)本切忌反復(fù)凍融，以免降低血清中的抗體或抗原的免疫活性。分離血清最好是讓血液在室溫中放置一定時(shí)間，使其自然凝固后將許晴析出，血液標(biāo)本不宜置于4℃下凝固，以防丟失大量的IgM及部分IgO.
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