脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

DHAR 存在于細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中。DHAR 催化 GSH 還原 DHA 生成 AsA 和 GSSG，調(diào)控細(xì)胞 AsA/DHA 比值，是抗壞血酸-谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶。提高植物體內(nèi)的 DHAR 活性，可提高植物食品中 AsA 含量，進(jìn)而提高植物食品的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

測(cè)定原理：

DHAR 催化 GSH 還原 DHA 生成 AsA，通過測(cè)定 DHA 減少速率，計(jì)算 DHAR 活性。

實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備：

研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 35 mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。

粗酶液提取：

1. 按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議

500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；8000g 4℃離心 20min，取上清液置冰上混勻待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

DHAR 測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 265nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

3. 在 1mL 石英比色皿中依次加入 100μL 上清液、100μL 試劑三、100μL 試劑四和 700μL 試劑二，迅速混勻后于 265nm 比色，記錄 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2，△A=A2-A1。

DHAR 活性計(jì)算公式：

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。 DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(Cpr×V 樣)÷T

= 92×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 92×△A ÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

= 92×△A ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷V 樣÷T

= 92×△A

ε ：AsA 在 265nm 處摩爾吸光系數(shù)為 5.42×10⁴ L/mol /cm；10⁹：摩爾分子換算成納摩爾分子；d：比色杯光徑，1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1mL=0.001 L；V 樣：反應(yīng)體系中加入上清液體積，100μL =0.1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min。

注意事項(xiàng)：

臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存，3 天內(nèi)使用完。

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