高效液相色譜法中流動(dòng)相的選擇
在液相色譜中，可供選擇的流動(dòng)相的范圍較寬，且還可組成多元溶劑系統(tǒng)與不同配比，在固定相確定后，流動(dòng)相的種類、配比、ph值及添加劑等能顯著影響分離效果，因此HPLC中流動(dòng)相的選擇至關(guān)重要。
（1）液-固吸附色譜的流動(dòng)相：在液-固吸附色譜法中，流動(dòng)相對(duì)分離的影響比較顯著，控制分離選擇性和分離速度主要靠選擇合適的流動(dòng)相來實(shí)現(xiàn)。一般采用二元以上的混合溶劑系統(tǒng)，在低級(jí)性溶劑如烴類中，加入是兩極性溶劑如三氯甲烷、春蕾等以調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性。
（2）化學(xué)鍵合色譜的流動(dòng)相：可采用固定比例（等度洗脫）或按規(guī)定程序改變比例（梯度洗脫）的溶劑組成作為流動(dòng)相系統(tǒng)，在液-固吸附色譜法中，一般采用二元以上的混合溶劑系統(tǒng)，在低級(jí)性溶劑如烴類中，加入是兩極性溶劑如三氯甲烷、醇類等以調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性；在液-液分配色譜法中，流動(dòng)相極性較小于固定相極性稱為正相色譜；流動(dòng)相極性大于固定相極性稱為返現(xiàn)色譜。正相色譜用于分離極性及中等極性的分子型化合物；返現(xiàn)色譜用于分離非極性至中等極性的分子型化合物。在藥物分析中，反省色譜應(yīng)用最廣。在反相色譜法中，由于固定相是非極性的，所以，流動(dòng)相極性越弱，其洗脫能力越強(qiáng)。典型的反相色譜法是用非極性固定相，常用十八烷基鍵合相（ODS或C18),流動(dòng)相用甲醇-水或乙腈-水。洗脫時(shí)，極性打的組分線流出色譜柱，極性小的組分后流出色譜柱。由于C18鍵在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對(duì)于反向色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常不低于5%。否則C18鍵的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。
反向鍵合相色譜的流動(dòng)相常選用下列三種：1 部分含水溶劑；以水為基礎(chǔ)溶劑，在加入一定量可與水互溶的有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑（如甲醇、乙腈、四氫呋喃），適用于分離中等極性、弱極性藥物、常用甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)。2 非水溶劑：用于分離疏水性物質(zhì)，尤其在柱填料表面鍵合的十八烷基硅膠量較大時(shí)，固定相對(duì)疏水化合物有異常的保留能力，需要有機(jī)溶劑，可在乙腈或甲醇中加入二氯甲烷或四氫呋喃（稱非水反相色譜）。3緩沖溶液；適用于可溶于水病可解離的化合物，如蛋白質(zhì)、多肽及弱酸、弱堿類成分。緩沖液及其PH值不同會(huì)影響組分的保留值，常用的緩沖液有三乙胺磷酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液，選用的ph值應(yīng)使用溶質(zhì)盡可能成為非解離形式，使固定相有較大保留能力（反向離子抑制色譜）。
爭(zhēng)相鍵合相色譜的流動(dòng)相通常采用飽和烷烴（如正乙烷）中加入異丙醚等極性較大的溶劑作為極性調(diào)節(jié)劑，通過調(diào)節(jié)劑的濃度來改變?nèi)軇⿵?qiáng)度，常采用二元以上的混合溶劑系統(tǒng)，可用薄層色譜（TLC）探索合適的流動(dòng)相。
返現(xiàn)離子對(duì)色譜的流動(dòng)相為極性較強(qiáng)的水系統(tǒng)混合溶劑，最常用的是甲醇-水、乙腈水中加入0.003-0.01mol/L的離子對(duì)試劑，調(diào)節(jié)有機(jī)溶劑的比例使組分K值在適宜范圍。離子對(duì)試劑的性質(zhì)和濃度、流動(dòng)相的PH值及流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的性質(zhì)和比例都會(huì)影響組分的保留值和分離的選擇性。
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