單克隆抗體（McAb）要用體外細胞培養(yǎng)建立永久性產(chǎn)生的抗體的細胞株的方法制備目前多用人、鼠的致敏B淋巴細胞與小鼠的骨髓瘤細胞（Sp2 O .NS（等）融合。使之在體外無限制生長產(chǎn)生抗體。

首先要用抗原面議動物，已得到致敏B淋巴細胞�；蛘哂扇梭w內(nèi)選取淋巴結(jié)，外周血或病原組織的致敏B細胞。用這些細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合，建立產(chǎn)生McAb的永久性細胞株。目前雖有用人致敏淋巴細胞與人骨髓瘤細胞進行雜交，建立人-人雜交瘤技術(shù)的報道，但是很不穩(wěn)定。一般用于面議組織化學的McAb.基本上都是用小鼠-小鼠雜交瘤制備的。
    免疫動物用Balb/c純種小鼠。免疫方法即途徑如前，但多經(jīng)腹腔注射30-50ug可溶性抗原。并與等量完全或不完全佐劑混合。也有人經(jīng)靜脈或脾免疫小鼠。但經(jīng)血路免疫時應(yīng)注意有發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的危險。用細胞免疫時。細胞數(shù)以為好。不要低于。經(jīng)一次或二次免疫后，可從眼靜脈放血檢測血清中有無抗體存在，若有可見的瓊脂雙擴散效價，則于最后一次經(jīng)靜脈加強免疫3天后由眼靜脈放血殺死動物，取脾植被脾細胞懸液。這時的脾B細胞已被激活。病能產(chǎn)生的抗體，是細胞融合的最佳狀態(tài)。殺死動物手機血清可留作多克隆抗體(PcAt)對照血清。

用作細胞融合的小鼠骨髓瘤細胞Sp2/o細胞系從小鼠骨髓瘤細胞培養(yǎng)的無分泌Ig能力的細胞系。在融合前，應(yīng)在培養(yǎng)基中加8-氮鳥嘌呤。經(jīng)2-3次代傳，以增加其對選擇培養(yǎng)基中的氨甲喋呤敏感性后才能使用。融合前的Sp 2/O細胞應(yīng)生長活躍。換液后1-2天，即可長滿培養(yǎng)瓶。沖洗并收集起來經(jīng)過稀釋后。在血細胞計數(shù)器中計細胞總數(shù)（細胞總數(shù)為 x 每大格細胞平均數(shù) x 稀釋倍數(shù) x 體積ml數(shù)）。一邊取一定數(shù)量與脾細胞融合。脾細胞來自已免疫的Baib/c小鼠。進行融合前將小鼠外部消毒后取脾。放在預(yù)先置好的小杯上的率網(wǎng)上，剪成碎片。并將單純培養(yǎng)液將脾細胞通過濾網(wǎng)沖入培養(yǎng)基中成為脾細胞懸液，按上法計每ml的脾細胞數(shù)及總數(shù)。

按1：2-1:10的比例混合骨髓瘤細胞及脾細胞。離心1000rpm。5分鐘。繼而輕擊管底使細胞重新懸浮。并將1ml的聚乙二醇在1分鐘內(nèi)緩緩滴加在混合細胞中，并輕輕用吸管吹打數(shù)次(PEG）是一種促溶劑。能改變細胞膜促進細胞融合。

放置2分鐘后，加1ml單純培養(yǎng)液。徐徐轉(zhuǎn)動試管使均勻混合以終止反應(yīng)。在放置5分鐘。離心去掉上清后，用選擇性培養(yǎng)液（HAT）稀釋之。使每ml中含5x個細胞 最后用吸管移入96孔板中，每孔0.2ml。置37℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

經(jīng)融合的細胞懸液中，有已經(jīng)融合的細胞，也有沒有融合的細胞。而融合的細胞中。有脾細胞 脾細胞的融合細胞。有骨髓瘤-骨髓瘤細胞的融合細胞，當然也有骨髓瘤細胞與脾細胞的融合細胞。必須選擇骨髓瘤-脾細胞的肉能雜交細胞。

選擇培養(yǎng)的關(guān)鍵是單純培養(yǎng)液中加添HAT選擇培養(yǎng)液。這個培養(yǎng)液中的H是次黃嘌呤，A是氨甲喋呤 T是胸腺嘧啶核苷 A可以阻斷所有細胞通過正常途徑合成DNA的途徑，這樣細胞就會死亡 幸而培養(yǎng)液中還包括有H及T。假若細胞中有次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT酶），就有可能通過HGPRT酶轉(zhuǎn)化H而合成DNA，若細胞中還有胸腺嘧啶激酶(TK)酶。它又能利用T來合成DNA（搶救途徑）。而維持細胞增殖不治死亡。骨髓瘤細胞缺乏這兩種酶，所以在選擇培養(yǎng)基內(nèi)必然死亡。脾細胞有這兩種酶。但脾細胞在培養(yǎng)條件下如無致裂原及其生長因子存在，液無法生長。只有脾細胞-骨髓瘤細胞的融合細胞。既有這兩種酶又能無限制生長。所以在HAT培養(yǎng)集中得到順利增殖，此即選擇培養(yǎng) 但是，選擇后生長起來的并不是單克隆的。也有可能是多克隆的。所以必須克隆化。建立 真正的但克隆細胞系。

克隆化就是分離出單個細胞。使其通過分裂增殖而獲得一個遺傳特性十分均一的細胞全體的全部過程。經(jīng)過數(shù)次克隆化以后，才可能選育出單克隆細胞系�？寺』�的方法有二。有限稀釋法，即將含有一定數(shù)量的細胞懸液，經(jīng)過多次倍比稀釋，由1:2/1:4,1:8,1:16,1:32,1:64 直至稀釋到微孔培養(yǎng)板中每孔可能只含一個細胞的濃度，放在CO2孵箱內(nèi)是之增殖，這樣可能得到單克隆抗體細胞系。但是一次克隆化往往不能達到目的。一般需要重復三次以上，2、顯微操作法，在顯微鏡下用吸管吸出單個細胞進行培養(yǎng)。

在克隆化時，必須進行抗體檢測，以確定是否得到了單克隆細胞系。當把一個產(chǎn)生所需抗體的陽性培養(yǎng)孔中的細胞進行有限稀釋并分別移至96孔板上生長時，若發(fā)現(xiàn)部分孔培養(yǎng)后細胞分泌抗體。部分孔不分泌抗體。說明至少還有兩個克隆的細胞同時存在，還需要進一步克隆化，若克隆化以后。所有孔都產(chǎn)生同樣抗體，則大致說明可控化已經(jīng)完成。所以克隆化與抗體檢測工作需密切配合。

檢測抗體是鑒定和篩選所需克隆的極重要的一步。目前常用的檢測方法有免疫組織化學。酶聯(lián)免疫吸附試驗（elisa）以及放射免疫或免疫放射法。檢測方法選擇應(yīng)服從于所制備的單克隆抗體的主要目的和用途，最好將用途與檢測方法結(jié)合，如主要用于免疫組織化學。可用elisa或放射免疫方法篩選 若所制抗體主要用于ELISA或放射免疫，可用ELISA或放射免疫方法篩選。單克隆抗體十分均一。不同抗體之間理化特性及類別可十分不同，并非每一單克隆抗體都同時可適用于elisa方式面議及面議組織化學等-但目前大多數(shù)人喜歡直接用免疫組織化學方法篩選。這是因為面議組織化學方法與其他方法比較不敏感。免疫組織化學方法能做出者。Elisa及放射免疫往往不成問題。反之，其他方法篩選的抗體，多數(shù)不能進行面議組織化學染色。所以。為了穩(wěn)妥起見。多選用免疫組織化學方法。常用石蠟包埋的組織篩選。但面議組織化學篩選的抗體也不一定能作其他用途。

常用的免疫組織化學方法。可根據(jù)條件選用固定液。用冰凍切片還是石蠟切片。也因抗原不同而又所選擇。因此，不能只使用一種方法、一種固定液就輕易宣布無所需的陽性克隆存在。同時抗體檢測常需在短期內(nèi)完成。實現(xiàn)要充分準備，以免丟失所需陽性克隆 雖然石蠟切片比冰凍切片檢測的敏感性差，但機構(gòu)清洗。需注意三方面的問題：1、用保存抗原好的固定劑如：乙醇、甲醇、丙酮、Bouin氏液以及種性緩沖福爾馬林。2、用快速或低溫石蠟包埋。為了快速。就要把組織塊切成2x5 x5mm的小塊。這樣經(jīng)過2-4小時的固定。透明、包埋及切片即可完成制片工作。為了更好地保存抗原活性采用碳蠟包埋，就更容易篩出抗體。3用敏感簡便的染色方法。如ABC法。有利于檢測培養(yǎng)上清中微量的抗體。

在細胞融合及克隆化階段，細胞基本上是微孔培養(yǎng)板上生長。每孔細胞數(shù)有限。所能產(chǎn)生的抗體量極微。擴大培養(yǎng)的方法很多，如用25ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)�？贵w產(chǎn)量就可以擴大近100倍。單用500ml及1L的培養(yǎng)瓶時，培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)液必需不斷轉(zhuǎn)動，細胞才能吸收足夠的CO2與O2，存活良好。這些方法即微管、微球法。都是向工業(yè)化生長過渡的方法。實驗室內(nèi)最常用的是吧雜交瘤細胞接種在小鼠腹腔內(nèi)。5天后腹水逐漸增多。其中含抗體濃度很高，去除腹水，就可以得到大量的抗體。

McAb是針對抗原的某一抗原決定簇的,與PcAb針對抗原的許多決定簇不同。他是與抗原的一個結(jié)合點反應(yīng)，所以是單價的。而PcAb可與抗原的許多決定簇發(fā)生反應(yīng)�？寺】贵w的分子結(jié)構(gòu)式相當一致的，與抗原起反應(yīng)的輕鏈，即可變區(qū)的氨基酸序列比較窄，但比PcAb的反應(yīng)特異。PcAb與抗原結(jié)合點多。結(jié)合力打，所以與抗原的親和力較強。因此，一般PcAb免疫組化染色較強，更加穩(wěn)定不容易洗脫，但往往引起較重的非特異直接面議組織化學染色的更好的條件。假若進行瓊脂雙擴散，只有少數(shù)McAb與抗暈?zāi)苄纬煽梢姷某恋砭�。而PcAb與抗原發(fā)生可見的沉淀反應(yīng)。有人認為這是因為McAb與抗原結(jié)合的復合物，在立體結(jié)構(gòu)上簡單化一，不如PcAb與抗原的結(jié)構(gòu)復雜。用作放免時，有些McAb不能標記。因而就不能再放免法中應(yīng)用。

分泌McAb的細胞株，一單建立并保持穩(wěn)定，就能源源不斷的大量的常勝質(zhì)地均一、功能相同、不易波動的McAb。因而可以寶成使用它的哥哥實驗室都能得出同樣的實驗結(jié)果，也就是容易標準化，使用PcAb則很難做到�，F(xiàn)將McAb與PcAb之間的差別列表如下：