流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史
流式細(xì)胞術(shù)是對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞器快速測(cè)量的高技術(shù)。依賴測(cè)量的參數(shù)，還可以用物理的方法將一個(gè)群體中的亞群分選出來(lái)，這就是流式細(xì)胞分選術(shù)。上述的“流式”，指的是在測(cè)量過(guò)程中細(xì)胞是流動(dòng)的，不是靜止的，這是與在此以前對(duì)細(xì)胞測(cè)量技術(shù)的最大差異之處。流式細(xì)胞術(shù)目前在國(guó)內(nèi)的一些有關(guān)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院已發(fā)展成常規(guī)技術(shù)，在我國(guó)，經(jīng)過(guò)十年的推廣也逐漸普及。經(jīng)過(guò)數(shù)十年的努力，流式細(xì)胞術(shù)從一個(gè)只能計(jì)數(shù)，稍后可測(cè)粒子大小的儀器，發(fā)展到今天可快速定量測(cè)定同一個(gè)細(xì)胞的多種化學(xué)的和物理的特性，這中間凝集著許多人的心血，既有成功，也有失敗。
第一個(gè)報(bào)道自動(dòng)計(jì)數(shù)細(xì)胞的是Moldavan（1934年），他描述了一個(gè)裝置：懸浮的血紅細(xì)胞或是用中性紅染色的酵母，在顯微鏡的載物臺(tái)上從一個(gè)毛細(xì)玻璃管中流動(dòng)，每個(gè)通過(guò)的細(xì)胞可被一個(gè)光電裝置記錄下來(lái)。他注意到了一系列技術(shù)上的細(xì)節(jié)。但此后一直沒(méi)有進(jìn)一步的報(bào)道。現(xiàn)在，人們都把這個(gè)實(shí)驗(yàn)看成是有關(guān)流式細(xì)胞術(shù)的第一個(gè)嘗試。1941年，沒(méi)有什么更新的內(nèi)容。
通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)，人們發(fā)現(xiàn)，在流式細(xì)胞計(jì)細(xì)胞要流動(dòng)的狹窄管道中存在的最大問(wèn)題是大細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)阻塞通道，為解決這個(gè)困難，人們不禁想起1883年Reynolds用來(lái)研究管子中層流時(shí)使用的鞘液原理。Gucker等人在1947年就是用這個(gè)原理和光電技術(shù)結(jié)合起來(lái)對(duì)氣溶膠中的粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)，隨后，Grosland-Taylor利用同一原理在1953年設(shè)計(jì)了一個(gè)流動(dòng)室，用光學(xué)方法來(lái)計(jì)數(shù)血細(xì)胞。他讓?xiě)腋〉募?xì)胞慢慢地注入快速流動(dòng)的液柱中，這個(gè)液柱外面被層流鞘液包圍著，粒子在軸心流動(dòng)。這樣做有兩個(gè)好處：一是消除了大個(gè)顆粒阻塞現(xiàn)象；二是它可精確控制粒子進(jìn)入液柱的位置，使之在軸心上，這樣就建立了流體動(dòng)力聚焦的原理。今天，幾乎所有流式細(xì)胞術(shù)的液流原理都采用了上述技術(shù)。
1949年，Wallance Coultre申請(qǐng)了一個(gè)名叫“流動(dòng)的懸浮粒子計(jì)數(shù)方法”的專利，在專利的方法中，他使粒子通過(guò)一個(gè)小孔。只要粒子與懸浮的介質(zhì)間在電導(dǎo)率上有差異，小孔中粒子的存在與否既能引起可檢測(cè)出的電特性變化，此現(xiàn)象通常這被稱為Coultre效應(yīng)，他在此基礎(chǔ)上生產(chǎn)了Coultre計(jì)數(shù)器（1956年）。此后，還有一些人發(fā)展了各種粒子測(cè)量設(shè)備，但原理上都差不多。其中Parker和Horst在1953年申請(qǐng)的專利“同時(shí)計(jì)數(shù)紅、白血細(xì)胞的方法”，是用稀釋的血細(xì)胞懸浮在等滲液中，白細(xì)胞染成藍(lán)色，紅細(xì)胞仍為紅色，細(xì)胞通過(guò)一根導(dǎo)管再被一束光照射，透射光被分成紅、藍(lán)兩個(gè)成分并分別送到光電池上，這樣就可記錄通過(guò)的細(xì)胞是吸收了藍(lán)光還是紅光。于是，不但記錄了通過(guò)的細(xì)胞數(shù)目，還識(shí)別了通過(guò)的細(xì)胞是白細(xì)胞還是紅細(xì)胞，這已經(jīng)有點(diǎn)今日流式細(xì)胞術(shù)的意思了。此后，直到60年代中期，流式細(xì)胞術(shù)始終無(wú)多大進(jìn)展。
1965年，Kamentsky提出兩個(gè)新概念：一是用分光光度學(xué)定量測(cè)量細(xì)胞組分；另一個(gè)是細(xì)胞的不同組分可以被同時(shí)多參數(shù)測(cè)量，用以給細(xì)胞分類。最初曾用核酸的紫外吸收和可見(jiàn)光散射兩個(gè)參數(shù)同時(shí)測(cè)量未染色的細(xì)胞，測(cè)量的速度大約是每秒測(cè)500個(gè)細(xì)胞。他同時(shí)也是第一個(gè)用兩維直方圖顯示并分析多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)的人。他也是第一個(gè)用計(jì)算機(jī)接口到儀器上，記錄并分析多參數(shù)數(shù)據(jù)的人。他的這個(gè)裝置隨后改裝成商品儀器，商品名為Ortho Cytograph和Cytofluo rograph。
1968年，Dittrich和Gohde在英國(guó)申請(qǐng)了一個(gè)專利，名稱是“在分散體系中自動(dòng)測(cè)量和計(jì)數(shù)粒子的裝置”。他們?cè)跍y(cè)量粒子的熒光或磷光時(shí)，讓粒子平行于透鏡光軸的方向運(yùn)動(dòng)，并通過(guò)大數(shù)值孔徑物鏡的焦面，粒子通過(guò)焦面后再用一個(gè)沖洗液使之偏轉(zhuǎn)。該裝置使用了Kohler照明，因而在粒子運(yùn)動(dòng)的出口處可得到均勻的照明，這就免去了聚焦的問(wèn)題。這樣一個(gè)設(shè)備可以用Kohler照明進(jìn)行熒光的激發(fā)，也可以收集發(fā)射的熒光，光源使用氙燈或高壓汞燈。采用大的數(shù)值孔徑透鏡保證了激發(fā)光和收集發(fā)射光都有大的立體角，而較大的立體角又可在測(cè)量非對(duì)稱細(xì)胞時(shí)細(xì)胞不同的取向不致使信號(hào)發(fā)生變化。Gohde以很小的變異系數(shù)測(cè)量了細(xì)胞群體的DNA。按上述原理制成的商品名稱為Phywe lmpulscytopho-tometer簡(jiǎn)稱ICP，隨后生成的ICO22，直到今天還有人仍在使用。
在1967年，Van Dilla和Los Alamos小組率先發(fā)展了一種液流束、照明光軸，檢測(cè)系統(tǒng)光軸三者互相垂直的流式細(xì)胞計(jì)。這種不依賴顯微鏡的設(shè)備采用了由Grosland-Taylor設(shè)計(jì)的層流流動(dòng)室并使用氬離子激光器為照明光源。這種垂直相交的系統(tǒng)以后更進(jìn)一步發(fā)展，除了可測(cè)熒光外還可測(cè)量散射光，后來(lái)還把Coulter計(jì)數(shù)器也安裝進(jìn)去。他們第一個(gè)用熒光Feulgen反應(yīng)對(duì)細(xì)胞DNA染色，展示了DNA倍性和熒光間的線性關(guān)系，他們的DNA直方圖第一個(gè)清楚地顯示出細(xì)胞周期的G1時(shí)想、S時(shí)相，G1和M時(shí)相。他們第一個(gè)用同步培養(yǎng)的細(xì)胞論述了定量細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，而Gohde和Dittrich則是第一個(gè)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量DNA以確定細(xì)胞周期變化來(lái)研究藥物影響細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)的人。
至于流式細(xì)胞分選術(shù)，則首先是由Fulwyler在1965提出的，其改進(jìn)型是在1969年。他使用了Sweet在1965年使用的一個(gè)靜電墨水噴射液滴偏轉(zhuǎn)技術(shù)。這個(gè)技術(shù)原來(lái)裝在Coulter計(jì)數(shù)器上可使細(xì)胞按體積大小分類。與此同時(shí)，也是在1965年,Kamentsky獨(dú)立地申請(qǐng)了一個(gè)專利，這是一個(gè)在液流中經(jīng)過(guò)光度學(xué)或電學(xué)測(cè)量后分選細(xì)胞的方法。在此方法中利用了氣體動(dòng)力學(xué)、水力學(xué)和靜電學(xué)的技術(shù)。后來(lái)Friedman曾設(shè)計(jì)過(guò)一個(gè)用液流開(kāi)關(guān)分選的裝置，但較少使用，直到今天分選用的大部分仍然是電子學(xué)的方法，如Becton Dickinson公司的各種可供使用的FACS儀器仍然在應(yīng)用液滴偏轉(zhuǎn)的原理。
60年代和70年代，還有一些人在流式細(xì)胞術(shù)上做了不少的改進(jìn)，有代表性的是Ehrlich和Wheeless。他們用飛點(diǎn)掃描技術(shù)或縫掃描技術(shù)得到了細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面低分辨率的信息，從而改變了流式細(xì)胞術(shù)范疇的儀器都是零分辨率儀器的傳統(tǒng)觀點(diǎn)。
經(jīng)過(guò)上述一系列研究者的努力，到80年代，世界上流式細(xì)胞計(jì)的生產(chǎn)廠家已基本形成格局，在美國(guó)，以Becton-Dickinson公司和Coulter公司兩家為代表，各生產(chǎn)了一系列流式細(xì)胞計(jì)，B-D公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞計(jì)都冠以FACS，其原文是Fluorescence Activated Cell Sorter，即熒光激活細(xì)胞分選器，現(xiàn)在具有代表的型號(hào)是FACScan和FACStar pluso Coulter公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞計(jì)以Profile和EPICS 750為代表，最新產(chǎn)品還有EPICS Elite，但國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到。以上產(chǎn)品的光源都是氬離子激光器。歐洲的產(chǎn)品可以瑞士的Partec公司為代表，型號(hào)為CIIL和PSAII，其產(chǎn)品都是在前述ICO基礎(chǔ)上發(fā)展的，故光源都使用了高壓汞燈，但最新推出的PASIII亦可安裝激光光源。國(guó)外除了上述三家外，西德、挪威，法國(guó)、日本等國(guó)亦有產(chǎn)品；我國(guó)上海第二醫(yī)學(xué)院和中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所也先后研制成功，為國(guó)內(nèi)填補(bǔ)了一項(xiàng)空白。
進(jìn)入80年代以來(lái)，流式細(xì)胞術(shù)在儀器本身方面似乎除了完善70年代提出的多光束、多站技術(shù)外進(jìn)展不大。當(dāng)然，隨著計(jì)算機(jī)功能的提高，在數(shù)據(jù)存貯、顯示、分析方面日臻完善，人們的注意力逐漸集中到樣品制備方法，研制新的熒光染料，發(fā)展新的細(xì)胞特征標(biāo)記物等方面，這樣就開(kāi)拓了一系列新的應(yīng)用。同時(shí)，儀器本身也就容易為一般研究者所掌握，也就更易普及。
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