實體組織分散為單個細胞的實例
Pallavivini為了進行細胞周期動力學(xué)分析，分散實體瘤常用中性蛋白酶處理細胞，具體步驟是：
1、配制中性蛋白酶（Neutral Protease）（Boehringer—Mannheim，Indiapolis，IN）消化液：以1mg/ml的濃度將中性蛋白酶溶解在無鈣離子的PBS中（pH7.4），3g瘤組織約需要25ml消化液。
2、取下瘤塊在冷PBS中截成幾小塊，再轉(zhuǎn)入中性蛋白酶中，剪碎瘤塊。
3、37℃恒溫振蕩1小時。
4、將過濾后的細胞懸液，用PBS離心洗兩次。
5、棄上清，將細胞沉淀打勻，用注射器或細吸管將細胞噴入預(yù)冷的70%乙醇中固定。
6、至少固定細胞12小時后，即可進行染色。
Pallavivini比較了中性蛋白酶、胰酶加DNA酶兩種酶處理KHT實體瘤分散單個細胞的效果，為了比較分散的細胞群體中各周期時相的分布，將接種實體瘤的小鼠注射3H—胸腺嘧啶核苷，然后取一半瘤用來比較兩種酶處理的效果，另一半瘤被固定后制備成組織切片，通過放射自顯影比較酶分散的細胞懸液中和組織切片中細胞的標記指數(shù)。比較的結(jié)果是：兩種酶消化處理的細胞懸液和組織切片獲得的標記指數(shù)沒有顯著的不同，但表明兩種酶處理對獲得含量較小的亞群都不夠敏感。此外，兩種酶處理比較的其它結(jié)果是：用中性蛋白酶處理，比DNA酶加胰酶混合酶處理小鼠KHT肉瘤所形成的單個細胞，在體內(nèi)或體外克隆形成力高約1.5倍，細胞產(chǎn)額高約2倍。用兩種酶處理所得到的DNA分布圖質(zhì)量都很高，變異系數(shù)約為3—5%，碎片和叢結(jié)都較少。因此，對于KHT肉瘤細胞，兩種酶處理法都是可行的。
實體組織分散為單個細胞的另一個例子是美國Roche-ster醫(yī)科大學(xué)耿中平等人對3種動物瘤和4種人的實體瘤進行了實體瘤分散實驗。他們發(fā)現(xiàn)，只用機械法分散實體瘤速度快，但細胞失活率大。他們用4種酶消化液進行了一些對比實驗，消化結(jié)果表明，3種酶混合液的效果大大優(yōu)于膠原酶，而膠原酶又優(yōu)于胰酶加DNA酶，使用胰酶效果最差。效果好的酶對于宿主細胞而言，可以獲得較高比例的瘤細胞，較高比例的S期和G2M期細胞和較高的克隆形成能力。下面介紹他們的實體瘤分散步驟：
（1）、從動物身上取瘤后，立即投入4℃含有10%小牛血清的消毒的培養(yǎng)介質(zhì)中。
（2）、取0.2—0.5g瘤組織并切碎。
（3）、將切碎的瘤組織放入一個盛有25ml 3種酶混合液的瓶中，濃度見前。
（4）、37℃恒溫消化30—60分鐘。消化后過濾，再將過濾后的細胞懸液在400g下離心10分鐘。
（5）、棄去混合液，用含10%小牛血清的新鮮組織培養(yǎng)液將已被分散的瘤細胞洗兩次。
（6）、將細胞重新懸浮在完全的組織培養(yǎng)介質(zhì)中。
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