乙酰輔酶 A（ Acetyl-CoA）含量測(cè)定試劑盒說明書
分光光度法 25 管/24 樣
測(cè)定意義
乙酰輔酶 A 廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。是生物體能源物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物。在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個(gè)樞紐性的物質(zhì)。糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)通過乙酰輔酶 A 匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，經(jīng)過這條通路徹底氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于 ATP 合成。此外，乙酰輔酶 A 是合成脂肪酸，酮體，膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。
測(cè)定原理
蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和 NAD 生成草酰乙酸和 NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶 A 和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶 A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反應(yīng)，乙酰輔酶 A 含量和 NADH 的生成速率成正比，340nm 下吸光值的上升速率反應(yīng)了乙酰輔酶 A 含量的高低。
需自備的儀器和用品
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存。臨用前加入 250μL 試劑五充分溶解備用。試劑三：液體×1 支，4℃保存。臨用前加入 250μL 試劑五充分溶解備用。試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存。臨用前加入 22.5μL 試劑五充分溶解備用。試劑五：液體×1 瓶，4℃保存。
工作液的配制：臨用前請(qǐng)根據(jù)擬用工作液體積（樣本數(shù)×0.92 m L），將試劑二、三和四按照 1:1:90 的比例混合，或者直接把試劑二和試劑三加入到試劑四中混勻（可以測(cè)定 24 樣）；加樣前置 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴鍋中預(yù)熱 30 min。
乙酰輔酶 A 的提取
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的
比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，用蒸餾水于 340nm 處調(diào)零。
2、取 920μL 工作液和 100μL 樣本至 1mL 石英比色皿，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 的吸光值 A1 和 80s 時(shí)的吸光值 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
3、乙酰輔酶 A 含量計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 1640x + 0.012；x 為吸光值，y 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）。注意：本試劑盒最低檢測(cè)限為 1.6nmol/mL。
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
乙酰輔酶A 含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×ΔA＋0.012) ÷Cpr
需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
乙酰輔酶 A 含量(nmol/g 鮮重)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012)
÷W
(3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
乙酰輔酶 A 含量(nmol/104)=[(1640×ΔA＋0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012)÷500 V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V2：
加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。
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